AGS 细胞成球能力、典型形态与培养条件

核心结论

AGS 的自主成球能力较强。在圆底超低附着培养体系中，不加入外源基质或支持细胞，也能够稳定形成一孔一个主要三维主体。[2][3]

一套直接条件为：圆底 96 孔超低附着板，每孔接种 1,000 个 AGS 细胞，加入 200 μL 高糖 DMEM 和 10% FBS，培养 6 天。该条件下可获得直径约 550 μm 的单球，每个球体约含 14.0 ± 0.3 × 10³ 个细胞；研究将其描述为形成快速、重复性较高的紧密球体，并观察到少量中央坏死细胞。[3]

但 AGS 的紧密程度并不是脱离方法后固定不变的特征。另一项直接比较使用 RPMI 1640、10% 热灭活 FBS 和超低附着板时，AGS 虽然形成连续三维聚集体，却是 AGS、MKN45、MKN74 和 NCI-N87 四种胃癌细胞中体积较大、最松散、致密度最低的一种；同一研究改用琼脂糖微模限制细胞分布后，获得的结构更小、更紧密。[2]

因此，AGS 最重要的实验判断不是简单回答“有没有聚成一个球”，而是确认当前方法预计产生哪一种结构：

• 圆底 ULA、高糖 DMEM 条件下可形成较紧密、适合实时成像和药效检测的单球；
• RPMI 条件下的 ULA 培养可能形成较大、较松的连续聚集体；
• 微模约束或加入 CAF 会进一步改变尺寸和压实程度；
• 普通含血清 MCTS 的形成能力不能用于推断无血清干性球实验一定成功。

先按培养方法判断当前结果

圆底 ULA、高糖 DMEM 单球模型

在 1,000 个细胞/孔、200 μL 高糖 DMEM 加 10% FBS、培养 6 天的直接方案中，通常合理的表现包括：[3]

• 一个孔内形成一个位于孔底中央的主要球体；
• 细胞由早期聚集逐步压实，边界连续；
• 同一板多数孔的球体数量、位置和大小接近；
• 第 6 天球体直径处于约 550 μm 的量级；
• 球体结构足以支持实时成像、MTT、凋亡和药物处理；
• 组织切片中可能出现少量中央坏死细胞，但主体仍保持完整。

以下表现更需要排查：

• 一个孔内持续存在多个彼此分离的大团块；
• 细胞贴附孔底并向外铺展；
• 聚集体轻微移动或换液后完全散开；
• 同板出现大量无球、多球和异常大球混杂；
• 培养至预定时间仍没有连续主体；
• 中央死亡范围明显扩大，并伴随外围脱落、主体塌陷或活率显著下降。

约 550 μm 是上述完整条件下第 6 天的直接结果，不是所有 AGS 培养方法的固定目标。改变培养基、血清比例、板型、体积、接种量或培养时间后，应重新建立尺寸基线。

RPMI 1640 条件下的形态与糖基化模型

另一项研究将 1,000 个 AGS 细胞接种到 ULA 板，在 RPMI 1640 GlutaMAX 和 10% 热灭活 FBS 中培养，第 5 天形成三维结构，随后用于糖基化抑制和表型分析。[2]

在这套方法中，AGS 的典型特点是：

• 主体通常能够形成，但结构相对较大、较松；
• 致密度低于同批比较的 MKN45、MKN74 和 NCI-N87；
• 接种量和培养时间变化并未消除其相对松散的特点；
• 不能要求其达到 NCI-N87 式的小而高度紧密形态。

因此，在该方法下，边界不够光滑或致密度偏低并不自动表示失败。更应关注：

• 是否形成连续的主要聚集体；
• 聚集体是否能够稳定维持到计划终点；
• 孔间尺寸和形态差异是否可接受；
• 是否存在贴壁铺展、长期多中心或持续崩解。

同一研究使用琼脂糖微模形成三维结构时，几何约束使细胞更集中，所得 AGS 结构更小、更紧密。[2] 这说明圆整度和压实度既反映细胞间黏附，也受到培养空间和汇聚方式影响。

根据研究目的选择实验路径

路径一：建立标准化的无基质单球药效模型

适用于：

• 一孔一球实时成像；
• 药物引起的生长抑制、细胞死亡和凋亡分析；
• MTT 或荧光活性检测；
• 需要较高孔间重复性的短期药效实验。

直接条件为：[3]

• 圆底 96 孔超低附着板；
• 1,000 个 AGS 细胞/孔；
• 200 μL 高糖 DMEM；
• 10% FBS；
• 培养 6 天后进入处理；
• 第 6 天球体直径约 550 μm；
• 每个球体约含 14.0 ± 0.3 × 10³ 个细胞。

该模型已用于多西他赛、洛伐他汀及联合处理后的生长、活率和凋亡检测。[3]

进入给药前，应记录球体面积或直径、圆度、单球率和中央死亡基线。第 6 天已可见少量中央坏死细胞，因此药物引起的死亡必须与未处理对照的基础中央死亡区分。

路径二：建立三天形成的短期药物反应模型

另一项直接研究采用：[4]

• AGS 细胞；
• RPMI 1640 加 10% 血清；
• Corning spheroid microplate；
• 5,000 个细胞/孔；
• 先培养 3 天形成球体；
• 随后进行 6 天处理；
• 每 2 天更换培养液。

这套方案适合在较短成球期后开始药物处理。研究报告了球体体积随处理变化，但没有给出可作为通用基线的第 3 天典型直径，因此不能从其他 AGS 方法借用约 550 μm 作为该方案的合格标准。

选择这一路径时，应在给药当天记录未处理球体的实际尺寸分布，并以同批对照判断后续生长或缩小。

路径三：研究形态、细胞黏附和糖基化变化

用于比较胃癌细胞的形态和糖基化表型时，可参考：[2]

• ULA 板中接种 1,000 个 AGS 细胞/孔；
• RPMI 1640 GlutaMAX；
• 10% 热灭活 FBS；
• 第 5 天形成后开始抑制剂处理；
• 第 7 天成像，并再次处理至第 10 天。

同一研究还采用琼脂糖微模培养，并在第 5 天换液、第 7 天固定。[2]

这一路径的核心读数不只是直径，还包括：

• 面积；
• 圆度；
• 致密度或 solidity；
• 糖链和糖蛋白表达；
• 处理前后结构是否收缩、松散或解体。

AGS 缺乏功能性 E-cadherin，被认为与其在该比较中较弱的细胞间黏附和低致密度有关。[2] 因此，处理导致的结构变化需要与 AGS 原本较松的基础表型比较，而不是与其他胃癌细胞的绝对形态比较。

路径四：建立 AGS 与癌相关成纤维细胞共培养球

直接研究将 500 个 AGS 细胞与 500 个 CAF 按 1:1 组合，在圆底 ULA 板中形成双细胞球体。[3]

研究观察到，AGS 与 CAF 组成的球体比相同数量的单独 AGS 细胞形成的球体更小、更紧密。该模型可用于研究：

• 肿瘤细胞与基质细胞相互作用；
• CAF 对三维结构和压实程度的影响；
• 单细胞球与双细胞球之间的药物反应差异；
• 肿瘤和间质成分共同存在时的活率与死亡。

共培养球体的尺寸和紧密度不能反推 AGS 单独培养时的自主成球能力。比较时还应保持 AGS 数量、总细胞数、CAF 比例和球龄一致，否则结构差异可能来自起始组成不同。

不同直接方法的时间与结果

这些结果不能拼接为一条统一时间线。第 3、5 和 6 天分别来自不同板型、培养基、接种量和实验终点。

出现问题时的排查顺序

第一步：确认低附着表面和孔底几何

AGS 在圆底 ULA 中可以形成一孔一个主要结构。若出现贴壁铺展、多个长期分离的团块或聚集中心偏离孔底，先确认：

• 板是否为真正低附着表面；
• 孔底是否能够将细胞汇聚到单一中心；
• 表面是否在操作中受到划伤或污染；
• 培养板是否被频繁移动或震动。

第二步：检查单细胞悬液和接种一致性

接种前残留大团块会直接造成多球、偏心结构和孔间差异。应检查：

• 消化是否充分；
• 吹打后是否仍存在明显细胞团；
• 计数和混匀是否稳定；
• 加样后是否及时、平稳地放入培养环境。

第三步：确认没有拼接不同研究的参数

以下条件不能任意互换：

• 高糖 DMEM 与 RPMI 1640；
• 1,000 与 5,000 个细胞/孔；
• 圆底 ULA、spheroid microplate 与琼脂糖微模；
• 第 3、5 和 6 天形成窗口；
• 单细胞球与 CAF 共培养球。

若首次建立模型，应完整复现一套直接方案，再逐项优化，而不是同时改变接种量、培养基、体积和板型。

第四步：按方法解释紧密度

AGS 在一套高糖 DMEM 圆底 ULA 方法中形成紧密球体，在另一套 RPMI ULA 比较中则表现为较松、低致密度结构。[2][3]

因此：

• 松散并不自动等于不能成球；
• 紧密也不能脱离培养条件视为 AGS 的固定表型；
• 应使用同方法、同球龄的未处理对照判断异常；
• 自动图像分析前应先确认分割算法能识别较松边界。

第五步：检查尺寸和中央死亡

第 6 天约 550 μm 的紧密 AGS 球体已可出现少量中央坏死细胞。[3] 若实验需要分析药物诱导死亡，应同时记录：

• 给药前球体尺寸；
• 未处理对照的基础死亡；
• 中央死亡区域是否随时间扩大；
• 外围活细胞层是否仍连续；
• 球体缩小是生长受抑、解体还是细胞死亡。

第六步：核对细胞版本和模型组成

荧光标记株、耐药株、基因编辑株及长期高传代细胞的聚集和药物反应可能偏离亲本 AGS。CAF 共培养还会改变结构压实程度。应明确记录：

• 细胞来源和传代范围；
• 是否经过稳定转染或药物筛选；
• 是否加入 CAF 或其他支持细胞；
• 单细胞球与共培养球的总细胞数和组成比例。

球体内部状态与药物读数

AGS 球体达到数百微米后，明场外观不足以单独判断模型质量。

第 6 天约 550 μm 的球体可保持完整和较高重复性，同时出现少量中央坏死细胞。[3] 因此，较大的紧密球体并不等于内部全部存活。

药物实验建议将以下读数分开解释：

• 球体面积或直径；
• 圆度和致密度；
• 代谢活性；
• Annexin V、caspase 或其他凋亡指标；
• 中央与外围的活死分布；
• 球体整体缩小、边界解体和细胞脱落。

结构缩小可能来自增殖停止、细胞死亡、细胞脱落或压实变化。仅根据明场面积不能确定具体机制。

普通 MCTS 与无血清 tumorsphere 不能互相替代

AGS 能在含血清圆底 ULA 条件下形成普通多细胞肿瘤球，不代表它在无血清干性筛选中一定形成 tumorsphere。

一项胃癌干细胞研究将少量细胞接种到超低附着 96 孔板，在含 EGF 和 bFGF 的无血清培养基中培养 3–4 周。MKN45 和 NCI-N87 可形成 spheroid colony，而 AGS 在该条件下未形成相应克隆球。[5]

另一项比较多种胃癌细胞系的研究同样报告，AGS 在其无血清 tumorsphere 条件下未形成球体，而部分其他胃癌细胞能够形成。[6]

这两类结果并不矛盾：

• 普通 MCTS 主要反映细胞在含血清低附着环境中的聚集、压实和三维生长；
• tumorsphere 主要反映少量细胞在选择性无血清条件下的存活、自我更新和克隆扩增；
• 两者的培养基、起始细胞数、培养时间和研究终点不同；
• 普通 MCTS 的形成时间和尺寸不能用于判断 tumorsphere 实验是否成功。

AGS 是什么细胞

AGS 是从未经治疗的人胃腺癌活检组织建立的长期培养细胞系。原始建系研究报道了一组可长期传代的胃腺癌克隆，并对其生长、染色体、形态和药物反应进行了表征。[1]

AGS 常用于：

• 胃癌细胞黏附和上皮表型研究；
• 胃癌药效和凋亡实验；
• 糖基化和黏蛋白研究；
• 肿瘤细胞与 CAF 相互作用；
• 幽门螺杆菌相关研究；
• 普通 MCTS 与干性球模型差异研究。

需要注意：

• AGS 是长期体外培养的单一细胞系，不能代表胃癌全部组织学和分子异质性；
• 其功能性 E-cadherin 缺失会影响细胞间黏附和三维形态；
• AGS 与 MKN45、MKN74、NCI-N87 或 HGT-1 的成球形态不能直接互换；
• 普通 AGS 单细胞球不能替代患者来源类器官、免疫完整模型或含复杂间质成分的组织模型。

总结

AGS 能在无外源基质的圆底低附着体系中可靠形成一孔一个三维主体，自主成球能力较强。直接研究中，1,000 个细胞/孔在高糖 DMEM、10% FBS 和圆底 ULA 板中培养 6 天，可形成约 550 μm、约含 14,000 个细胞的紧密球体。

AGS 最突出的对象特异特点是紧密度高度依赖方法：在另一套 RPMI 1640 ULA 比较中，它形成的是体积较大、较松、低致密度的连续聚集体；琼脂糖微模或 CAF 共培养又可使结构进一步压实。

判断 AGS 实验是否成功时，应先确认所采用的培养基、板型、接种量、球龄和模型组成，再比较单球率、连续性、致密度、孔间一致性和内部活性。不同方法的第 3、5、6 天结果和尺寸数据不能互相替代，普通含血清 MCTS 也不能用于推断无血清 tumorsphere 的形成能力。

参考来源

[1] Barranco SC, Townsend CM Jr, Casartelli C, et al. Establishment and characterization of an in vitro model system for human adenocarcinoma of the stomach. Cancer Research. 1983;43(4):1703–1709. PMID: 6831414. [2] Balmaña M, Mereiter S, Diniz F, Feijão T, Barrias CC, Reis CA. Multicellular human gastric-cancer spheroids mimic the glycosylation phenotype of gastric carcinomas. Molecules. 2018;23(11):2815. DOI: 10.3390/molecules23112815. [3] Alzeeb G, Arzur D, Trichet V, et al. Gastric cancer cell death analyzed by live cell imaging of spheroids. Scientific Reports. 2022;12:1488. DOI: 10.1038/s41598-022-05426-1. [4] Choi NR, Choi WG, Zhu A, et al. Exploring the therapeutic effects of Atractylodes macrocephala Koidz against human gastric cancer. Nutrients. 2024;16(7):965. DOI: 10.3390/nu16070965. [5] Takaishi S, Okumura T, Tu S, et al. Identification of gastric cancer stem cells using the cell surface marker CD44. Stem Cells. 2009;27(5):1006–1020. DOI: 10.1002/stem.30. [6] Pajuelo-Lozano N, Alcalá S, Sainz B Jr, Perona R, Sanchez-Perez I. Targeting MAD2 modulates stemness and tumorigenesis in human gastric cancer cell lines. Theranostics. 2020;10(21):9601–9618. DOI: 10.7150/thno.49270.