HepaRG 细胞成球能力、分化状态与长期肝功能模型

核心结论

HepaRG 的自主成球能力很强。预先分化的 HepaRG 细胞在圆底超低附着板和悬滴体系中均可依靠自身细胞间作用形成连续三维主体，无需外源细胞外基质或其他细胞提供结构支持。[3][4][5][6][7]

直接研究给出了三组可用于判断形成节奏的结果：

• 冻存分化型 HepaRG 以 1,000 个细胞/孔接种到圆底 96 或 384 孔超低附着板后，第 1–3 天逐步聚集，第 7 天形成紧密球体。384 孔板内平均直径为 192 ± 14 μm，第 7–28 天形态和尺寸基本稳定。[3]
• 分化型 HepaRG 以 2,000 个细胞/孔接种到 96 孔超低附着板后，第 1–3 天形成聚集体，第 7 天形成约 100 μm 的紧密球体，形态可稳定维持至第 21 天。[4]
• 另一套 2,000 个细胞/孔的胆汁淤积模型在第 4 天已形成边界清楚、约 200 μm 的紧密球体，并从第 5 天开始调整维持培养基和进入后续处理。[5]

这些数字来自不同培养基、补充剂和观察流程。第 4 天约 200 μm、第 7 天约 100 μm和第 7 天约 192 μm分别属于各自实验体系，不能合并成统一的尺寸或形成时间范围。

HepaRG 球体的主要控制点是细胞分化状态、每球起始活细胞数和培养基切换时间。1,000–2,000 个细胞的分化型 HepaRG 可形成适合长期代谢、重复给药、胆汁淤积和遗传毒性研究的稳定球体；提高到 5,000 个细胞可获得更大的结构，但中心死亡信号随球龄增加。超过 2,000 个细胞的高密度模型还可能出现中心暗区、压实延迟和较低的药物代谢酶活性。[3][6]

先确认使用的 HepaRG 状态

HepaRG 来源于一例与慢性丙型肝炎相关的肝肿瘤，具有双向分化潜能，可形成肝细胞样和胆管上皮样细胞群。[1][2] 同名 HepaRG 培养物可能处于不同状态，建立三维模型前应明确记录：

• 使用可增殖的未分化或低分化 HepaRG，还是供应商提供的冻存分化型 HepaRG；
• 二维阶段是否已经完成分化；
• 复苏后使用的培养基和添加剂；
• 三维培养中是否继续使用 DMSO、EGF、HGF 或其他维持因子；
• 球体在形成后是否进入胶原、海藻酸盐或功能聚合物等特殊支持环境。

目前最清晰的一孔一球基线主要来自冻存分化型 HepaRG 直接接种圆底超低附着板的研究。[3][4][5] 使用可增殖细胞在三维环境中继续分化时，球体增大速度、细胞组成和功能成熟时间可能不同，不能直接套用分化型细胞的第 4–7 天基线。

按研究目的选择培养路径

路径一：1,000 个细胞的长期代谢与重复毒性模型

一项高通量研究采用以下条件：[3]

• 冻存分化型 HepaRG；
• 1,000 个细胞/孔；
• 圆底 96 或 384 孔超低附着板；
• 每孔 50 μL Williams E 培养基；
• 使用 MHPIT induction additive；
• 每 2–3 天去除并补加 30 μL 培养基；
• 最长培养 28 天。

通常可见的形成过程为：

该体系中，1,000 个细胞/孔在结构和药物代谢酶活性之间表现出较好的平衡。CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4/5、白蛋白分泌和胆小管样转运功能均可维持。[3]

需要排查的表现包括：

• 第 3 天后仍有大量分散单细胞，未形成主要聚集中心；
• 第 7 天仍为多个彼此分离的大团块；
• 同板孔间球体数量或尺寸差异异常大；
• 早期即出现明显中心暗区并伴随 ATP 或活死结果下降；
• 换液后大量球体解体或黏附到孔底。

路径二：2,000 个细胞的遗传毒性模型

一项彗星实验研究采用：[4]

• 分化型 HepaRG；
• 2,000 个细胞/孔；
• 96 孔超低附着板；
• 第 1–3 天观察聚集；
• 第 7 天获得约 100 μm 的紧密球体；
• 第 10 天开始 24 或 48 小时化合物暴露；
• 球体可稳定维持至第 21 天。

该路径适合在保持代谢能力的同时，把球体解离为单细胞进行 DNA 损伤检测。进入处理前应记录球体尺寸、基础 ATP、未处理对照形态和 CYP 诱导反应。

第 7 天仍缺少连续主体、球体在第 7–10 天持续缩小并伴随基础 ATP 下降，或同板孔间形成节奏明显不一致，需要优先检查起始活细胞数、板型和早期换液操作。

路径三：2,000 个细胞的胆汁淤积模型

另一项研究同样使用 2,000 个活细胞/孔，但培养基和处理时间不同：[5]

• 冻存分化型 HepaRG；
• Williams E/GlutaMAX 与 ADD670 用于接种和早期培养；
• 第 4 天形成边界清楚、约 200 μm 的紧密球体；
• 从第 5 天起使用含 0.5% DMSO、ADD650、20 ng/mL EGF 和 10 ng/mL HGF 的维持培养基；
• 随后进行 8 或 14 天的重复药物和胆汁酸共暴露。

该模型保留 MRP2 和 BSEP 等胆汁转运相关表型，适合研究药物性胆汁淤积。第 4 天的形态和第 5 天的培养基切换属于这套方案的组成部分，不应与遗传毒性模型的第 7–10 天节点互换。

路径四：通过起始细胞数建立尺寸梯度

一项 ULA 研究比较了 1,000 和 5,000 个 HepaRG 细胞/孔：[6]

• 两组在第 3 天均形成球体样结构；
• 1,000 个细胞形成的球体约为 200 μm，第 3 天后尺寸变化较小；
• 5,000 个细胞形成的球体在第 6–7 天约为 350 μm；
• 两组圆度均随培养时间增加；
• 5,000 个细胞球体的内部死亡信号更强。

1,000 个细胞的球体更适合控制尺寸和降低中心死亡风险。5,000 个细胞的球体可用于研究尺寸、传质和后续胶原嵌入，但进入处理前需要直接检测内部活率，不能仅凭外形完整判断模型状态。

该研究还将预培养 4 天的 1,000 个细胞球体嵌入重组人 I 型胶原继续培养。嵌入后出现树枝状外生长和更强的肝分化相关表达。[6] 胶原阶段属于独立的细胞—基质模型，不用于评价 HepaRG 在无支架低附着环境中的自主成球能力。

悬滴和特殊支持模型

高细胞量悬滴球体

分化型 HepaRG 也可在 GravityPLUS 悬滴体系中形成球体。直接研究测试了 8,000 和 24,000 个细胞/40 μL 悬滴，并主要使用 24,000 个细胞的模型培养 7 天。[7] 三维培养提高了多种代谢相关基因表达，并改善白蛋白和 ApoB 分泌。

该模型的细胞数远高于 1,000–2,000 个细胞的 ULA 模型，形成结构、氧扩散距离和功能读数均不同。悬滴数据不能转换成圆底 ULA 的推荐接种量或目标直径。

功能聚合物、海藻酸盐微囊和胶原模型

功能聚合物 FP001 可持续控制细胞聚集，使 HepaRG 在长期培养中形成尺寸更均一的小球，并加快成熟肝细胞表型建立。[8] 海藻酸盐微囊可在无 DMSO 条件下支持 HepaRG 三维分化和胆小管样网络形成。[9] 胶原嵌入则用于观察基质中的外生长和分化变化。[6]

这些材料持续提供包埋、塑形或分化支持，实验目的与普通无支架一孔一球不同。相关时间、尺寸和功能结果应保留在各自模型内解释。

如何判断当前结果是否合理

对于 1,000–2,000 个分化型 HepaRG 的圆底 ULA 模型，以下表现有直接文献支持：

• 第 1–3 天逐步形成一个主要聚集中心；
• 第 4–7 天完成压实，形成边界连续的单球；
• 形成后尺寸保持相对稳定，而非持续快速膨大；
• 1,000 个细胞球体通常接近 150–200 μm量级；
• 球体可维持多周，并保留肝细胞样代谢和胆汁转运功能。[3][4][5]

以下表现需要进一步排查：

• 第 7 天仍有多个独立主体或大量分散细胞；
• 同板大量出现空孔、多球和异常大球体混杂；
• 球体很早出现明显中心暗区，且基础活率或 CYP 活性同步下降；
• 形成后的球体持续碎裂、黏附或在换液时大量丢失；
• 仅依据直径判断成功，却没有同步确认 ATP、活死状态或目标肝功能；
• 使用未分化细胞，却直接套用冻存分化型细胞的时间和尺寸标准。

明场中央变暗只能提示内部状态可能改变。中心死亡或坏死需要结合活死染色、ATP、组织切片或其他内部成像确认。

异常结果的排查顺序

1. 核对细胞状态和批次

确认细胞是冻存分化型、二维完成分化的细胞，还是仍具增殖能力的 HepaRG。记录复苏日期、二维培养阶段、传代信息和供应商分化方案。

2. 核对每孔起始活细胞数

以活细胞数计算接种量。1,000、2,000 和 5,000 个细胞对应不同尺寸、形成速度和内部死亡风险，不能只按总体积或细胞悬液浓度估算。

3. 检查低附着表面和孔底几何

直接的一孔一球研究使用圆底 ULA 板。表面失效、孔底存在黏附区域或使用平底板，均可能造成多中心聚集和孔间差异。

4. 复核培养基和切换日

MHPIT 体系、ADD670/ADD650 体系以及其他供应商培养体系使用不同添加剂。DMSO、EGF 和 HGF 的加入时间会改变分化和胆汁转运表型。培养基方案应按对应研究或已验证流程完整记录。

5. 减少形成早期的机械扰动

第 1–3 天是细胞汇聚阶段。吸头直接冲击球体、过量吸液或频繁移动培养板可能造成多球、碎裂或丢失。换液时保留足够液体并沿孔壁缓慢操作。

6. 同时检查结构和功能

长期肝模型需要同步记录：

• 单球率、直径和圆度；
• 中央暗区和基础活率；
• ATP 或其他代谢活性；
• 白蛋白、尿素或目标分泌指标；
• CYP 活性或诱导反应；
• MRP2、BSEP 或胆小管样结构；
• 未处理对照随球龄的变化。

球体外观一致但目标功能持续下降时，应重新检查起始细胞数、分化状态和培养基维持方案。

模型边界

HepaRG 可分化为肝细胞样和胆管上皮样细胞，适合长期代谢、药物性肝损伤、胆汁淤积和遗传毒性研究。[1][2][3][4][5] 它仍是肿瘤来源细胞系，不能替代供体来源的原代人肝细胞，也不能完整重建肝窦内皮、Kupffer 细胞、肝星状细胞和免疫系统。

HepaRG 与肝星状细胞、内皮细胞或巨噬细胞共同形成的异型肝球可增加微环境复杂度，但其压实程度、细胞分布和功能变化不能用 HepaRG 单培养球体的基线解释。共培养比例和加入时间需要作为独立模型参数记录。

参考来源

[1] Gripon P, Rumin S, Urban S, et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2002;99(24):15655–15660. doi:10.1073/pnas.232137699. [2] Parent R, Marion M-J, Furio L, Trépo C, Petit M-A. Origin and characterization of a human bipotent liver progenitor cell line. Gastroenterology. 2004;126(4):1147–1156. doi:10.1053/j.gastro.2004.01.002. [3] Ramaiahgari SC, Waidyanatha S, Dixon D, DeVito MJ, Paules RS, Ferguson SS. From the Cover: Three-Dimensional (3D) HepaRG Spheroid Model With Physiologically Relevant Xenobiotic Metabolism Competence and Hepatocyte Functionality for Liver Toxicity Screening. Toxicological Sciences. 2017;159(1):124–136. doi:10.1093/toxsci/kfx122. [4] Mandon M, Huet S, Dubreil E, Fessard V, Le Hégarat L. Three-dimensional HepaRG spheroids as a liver model to study human genotoxicity in vitro with the single cell gel electrophoresis assay. Scientific Reports. 2019;9:10548. doi:10.1038/s41598-019-47114-7. [5] Hendriks DFG, Fredriksson Puigvert L, Messner S, Moritz W, Ingelman-Sundberg M. Hepatic 3D spheroid models for the detection and study of compounds with cholestatic liability. Scientific Reports. 2016;6:35434. doi:10.1038/srep35434. [6] Liao F-C, Wang Y-K, Cheng M-Y, Tu T-Y. A Preliminary Investigation of Embedding In Vitro HepaRG Spheroids into Recombinant Human Collagen Type I for the Promotion of Liver Differentiation. Polymers. 2022;14(9):1923. doi:10.3390/polym14091923. [7] Takahashi Y, Hori Y, Yamamoto T, Urashima T, Ohara Y, Tanaka H. 3D spheroid cultures improve the metabolic gene expression profiles of HepaRG cells. Bioscience Reports. 2015;35(3):e00208. doi:10.1042/BSR20150034. [8] Higuchi Y, Kawai K, Kanaki T, Yamazaki H, Chesné C, Guguen-Guillouzo C, Suemizu H. Functional polymer-dependent 3D culture accelerates the differentiation of HepaRG cells into mature hepatocytes. Hepatology Research. 2016;46:1045–1057. doi:10.1111/hepr.12644. [9] Rebelo SP, Costa R, Estrada M, Shevchenko V, Brito C, Alves PM. HepaRG microencapsulated spheroids in DMSO-free culture: novel culturing approaches for enhanced xenobiotic and biosynthetic metabolism. Archives of Toxicology. 2015;89(8):1347–1358. doi:10.1007/s00204-014-1320-9.